Лаборатория генетики растений

Проводившиеся работы по изучению закономерностей замещения хромосом геномов A, B и D у мягкой пшеницы в системе инконгруентных скрещиваний T.aestivum (AABBDD),T.timopheevii (AtAtGG), T.Militinae (AtAtGG), T.kiharae (AtAtGGDsqDsq) позволили не только отселектировать линии яровой мягкой пшеницы, устойчивые к мучнистой росе и листовой бурой ржавчине, но и с использованием C-метода дифференциального окрашивания изучить их кариотипы. Показано, что передача чужеродного генетического материала в геном мягкой пшеницы осуществлялась за счет замещения целых хромосом At-, G- или D -геномов, хромосомных плеч или их фрагментов. Установленная высокая частота замещений по хромосомам 2At, 2G, 5G и 6G указывает на то, что в них могут находиться гены устойчивосни к фитопатогенам, а также на значительную близость этих хромосом гомеологам мягкой пшеницы, определяющую их высокую компенсационную способность.

Важные результаты были также получены при исследовании молекулярно-генетических основ механизмов устойчивости растений к фитопатогенам, естественно существующих в системах патоген – хозяин и искусственно вызываемых внедрением генноинженерных конструкций и применением вакцин. Были изучены характеристики феномена приобретенной устойчивости у растений, разработаны новые конструкции, позволяющие создавать устойчивость у растений к вирусам и проведена их оценка. Установлены молекулярные особенности апатогенного штамма вируса ВТМ (V-69) обуславливающего индукцию защитных реакций растений. Для исследования феномена приобретенной устойчивости использовали следующие модельные системы: растения огурца - вирус зеленой крапчатой мозаики огурца (ВЗКМО); трансгенные растения табака, экспрессирующи двунитевую РНК - вирус табачной мозаики (ВТМ) и растения картофеля - вирусы картофеля. Изучение приобретенной устойчивости растений к вирусам оценивали путем изучения вирусных белков и белков растений, образующихся в ответ на инфекцию. Впервые была определена первичная структура белка оболочки изолята no. 3 ВЗКМО-О, вызывающего на растениях огурца ярко выраженную мозаику, хлороз, появление белых пятен, а также угнетение роста растений. По сравнению с белком оболочки арбузного штамма ВЗКМО обнаружено 2 аминокислотные замены: Val-56 на Ala-56 и Asp-64 на Ser-64. Для изучения механизмов индуцированного иммунитета были получены трансгенные растения табака, экспрессирующие двунитевую РНК, нуклеотидная последовательность которой не несет гомологии с геномом табака. Исследована устойчивость трансгенных растений к вирусу табачной мозаики (ВТМ) путем анализа белков листьев зараженных растений. Обнаружены полипептиды с молекулярными массами 25 и 30 кДа. Результаты аминокислотного секвенирования пептида с молекулярной массой 30 кДа и последующий поиск по базам данных выявили, что он обладает гомологией с гидролазами из группы растительных бета-глюканаз. Обнаруженные полипептиды, по-видимому, связаны с повышенной устойчивостью трансгенных растений к ВТМ. При исследовании молекулярных особенностей апатогенного штамма вируса ВТМ впервые была определена первичная структура аттенуированного штамма ВТМ V-69 и его четырех патогенных ревертантов. Была обнаружена высокая консервативность первичной структуры ВТМ V-69 и его ревертантов. Показано, что единственная общая, обнаруженная в ревертантах нуклеотидная замена в положении 1654 (G>A), вызывающая аминокислотную замену Arg528 на His528, ответственна за проявление патогенных свойств. Следовательно, спейсерная неконсервативная область между метилтрансферазным и геликазным доменами в белках репликазы тобамовирусов является определяющей в аттенуации вируса. Полученные нами конструкции, несущие полноразмерные кДНК копии генома ВТМ V-69 являются базовыми как для направленного введения мутаций с целью получения вируса с измененными свойствами, так и для экспрессии гетерологических генов в растении.

Врожденный иммунитет растений представляет собой сложную систему защиты организма от патогенов, в которой особое место занимают антимикробные пептиды. Из семян гексаплоидной пшеницы Triticum kiharae впервые выделено и охарактеризовано 50 антимикробных пептидов, которые принадлежат к 5 из 6 известных у растений семейств, что ранее не было показано ни для одного вида растений. Среди выделенных пептидов полностью структурно охарактеризована новая группа D-дефензинов. Впервые изучен состав D дефензинов у диплоидных и тетраплоидных видов родов Triticum и Aegilops и впервые проведена геномная локализация генов, кодирующих D дефензины. Полученные результаты свидетельствуют о высоком внутривидовом полиморфизме дефензинов пшеницы, что, по всей видимости, обусловлено необходимостью противостоять широкому кругу фитопатогенов, а также о высоком консерватизме их аминокислотных последовательностей в эволюции, что свидетельствует о жизненно важных функциях этой группы антимикробных пептидов.

Полученные результаты расширяют наши представления о врожденном иммунитете растений. Наиболее биологически активные пептиды могут быть использованы на практике для создания трансгенных сельскохозяйственных растений с повышенной устойчивостью к патогенам, что более безопасно, чем используемое в настоящее время встраивание генов устойчивости бактериального происхождения и использование химических средств защиты растений.

Получен ряд трансгенных растений и клеточных линий табака и картофеля, отличающихся повышенной устойчивостью к фитопатогенам и стрессовым факторам. Разработаны методы микроклонального размножения редких и нетрадиционных культур (копеечник, хрен, амарант, стахис, сирень) с целью сохранения генетического биоразнообразия и получения суперпродуцентов ценных целевых продуктов, и созданы генетические коллекции депонированных асептических растений. Приоритетный характер имеет молекулярно-генетическое маркирование сложной в систематическом отношении группы видов и генотипов стахиса. Проводится исследование генетической изменчивости при культивировании растений in vitro.

Проводятся исследования по изучению генетического контроля и хромосомной локализации генов устойчивости ячменя к головневым заболеваниям ячменя, которые в ходят в состав 8 наиболее вредоносных заболеваний с.-х. культур. C использованием комплекса генетических маркеров (морфологические, биохимические и молекулярные) установлено, что ген Run 8, детерминирующий устойчивость к популяции рас головни, локализован в длинном плече хромосомы 5, а ген Run 6 – в длинном плече хромосомы 3 ячменя. Начата работа по локализации гена (генов) устойчивости ячменя к каменной головне ячменя на основе донора устойчивости, обнаруженного нами на Памире.

Ведутся исследования полиморфизма трех основных локусов, контролирующих запасные белки зерна ячменя – гордеинов как в мировой коллекции (центры разнообразия ячменя), так и на территории бывшего СССР, а сейчас – России. К настоящему времени идентифицировано 154 аллеля локуса Hrd A, 251 аллель локуса Hrd B и 5 – Hrd F. Вскрыта структура полиморфизма указанных локусов, выражающаяся в существовании семейств многокомпонентных блоков электрофоретических компонентов гордеинов. Это позволяет с принципиально иной точки зрения подойти к изучению вопроса происхождения культурного ячменя, который дискутируется до сих пор. Проведенные исследования гордеинов в сортах бывшего СССР и России, а также специальные эксперименты с гибридами и сортовыми популяциями позволили обнаружить зависимость распределения аллельных вариантов гордеиновых локусов от климатических факторов (влагообеспеченность, температурный режим) и от высоты над у.м. Полученные результаты свидетельствуют о сопряженности изменчивости по аллельным вариантам гордеиновых локусов и засухоустойчивости растений в период налива зерна. Высокая сортоспецифичность электрофоретических спектров гордеинов (более 80% сортов имеют уникальную генетическую формулу гордеина) позволило использовать метод электрофореза, разработанный в лаборатории, в качествеметода лабораторного контроля сортовой чистоты и сортовой принадлежности семенных и товарных партий ячменя. Этот метод утвержден Государственной семенной инспекцией МСХ РФ и используется как в научно-исследовательских учреждения, так и на солодовенных заводах РФ.

Использование современных молекулярно-генетических методов позволяет проводить обширный генографический анализ популяций злаков (культурные растения и их дикие сородичи), оценивать адаптивное значение эволюционно сложившегося генетического разнообразия природных и искусственно созданных популяций.