Геномная «шифровальная книга» — ключ к пониманию генной регуляции у человека

---

Новость по серии статей в журналах группы Nature с участием биоинформатиков из ИОГен РАН опубликована на сайте PCR.NEWS

Опубликованы результаты большого международного проекта Codebook по определению ДНК-паттернов («мотивов») и участков связывания транскрипционных факторов в геноме человека. Ученым удалось выявить десятки тысяч ранее неизвестных сайтов связывания малоизученных транскрипционных факторов. Такие знания необходимы для аннотации индивидуальных вариантов в регуляторных районах генома и поиска ключевых белков-регуляторов, определяющих пути дифференцировки клеток и изменения экспрессии генов при патологиях. Анализом ДНК-мотивов в консорциуме Codebook руководили российские биоинформатики, которые рассказали PCR.NEWS о своей работе.

подготовила Надежда Маркина

Что такое Codebook

В журналах Nature, Nature Communications и Nature Methods одновременно вышли четыре статьи с результатами большого международного проекта Codebook («Шифровальная книга»). Его цель — определить мотивы, специфические последовательности ДНК, которые узнаются белками — транскрипционными факторами (ТФ). Для нескольких сотен предполагаемых и плохо охарактеризованных человеческих ТФ ДНК-мотивы до сих пор оставались неизвестными. 

В консорциум Codebook входили и российские биоинформатики из Института общей генетики РАН (ИОГен РАН) и Института белка РАН (ИБ РАН) — член-корреспондент РАН Всеволод Макеев, доктор биологических наук Иван Кулаковский и их команды, включая студентов ФББ МГУ и МФТИ и аспирантов МФТИ, ИОГен РАН и ИБ РАН. 

Как рассказал PCR.NEWS Иван Кулаковский, идея проекта возникла после того, как в 2018 году профессор Тимоти Хьюз, профессор Юсси Тайпале и профессор Мэтью Вейраух — мировые звезды в области регуляторной геномики, представляющие Канаду, Финляндию и США, — опубликовали в журнале Cell обзор «The Human Transcription Factors». Они собрали подробнейшую информацию обо всех ТФ, аннотированных к тому моменту, и показали, что несколько сотен предполагаемых ТФ человека оставались без какой-либо информации о ДНК-мотивах связывания.

Позднее, в ходе работы другого международного консорциума (GRECO, по стандартизации терминологии в области регуляции экспрессии генов), инициаторы Codebook познакомились с российскими биоинформатиками, которые в предыдущих публикациях показали, как использовать вычислительные методы, для совместного анализа мотивов  по данным, полученным с помощью различных экспериментальных методов. Так наши ученые оказались плотно вовлечены в работу «Шифровальной книги».

Как указано во флагманской статье в Nature, в ходе выполнения проекта Codebook для малоизученных ранее ТФ исследователи провели более 4000 независимых экспериментов in vivo (на стандартной линии человеческих клеток HEK293; в статьях по биоинформатике термин in vivo может использоваться в этом контексте) и in vitro.

Методы и результаты

Для выявления ДНК-белковых взаимодействий использовали пять основных методов:

• ChIP–seq — метод анализа ДНК-белковых взаимодействий, основанный на иммунопреципитации хроматина (ChIP) и секвенировании ДНК.
• HT-SELEX - высокопроизводительная версия классического SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment, Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) — для получения олигонуклеотидов, которые специфически связываются с заданной мишенью, в данном случае с изучаемым белком.
• GHT-SELEX — модифицированный метод HT-SELEX, в котором вместо пула случайных олигонуклеотидов используется геномная ДНК (genomic HT-SELEX). Фрагменты геномной ДНК вытягиваются из раствора так же, как и в HT-SELEX — при помощи соответствующего иммобилизованного белка-ТФ.
• Protein-Binding Microarrays — обратный метод, похожий на ДНК-микрочипы. Здесь короткие молекулы ДНК фиксируются на микроматрице, и затем факт ДНК-белкового взаимодействия с конкретным олигонуклеотидом определяется по свечению флуоресцентной метки, используя антитела, специфичные к изучаемому белку.
• SMiLE-seq — высокотехнологичный аналог одного цикла HT-SELEX с использованием микрофлюидики для отделения комплексов «белок-ДНК».

В результате из 332 предполагаемых ТФ удалось установить мотивы для чуть более половины — 177 ТФ. Эти данные помогли выявить десятки тысяч ранее неизвестных сайтов связывания ТФ по всему геному человека. Важно отметить, что сайты связывания — это участки молекулы ДНК, с которыми связывается белок, а мотивы характеризуют конкретные последовательности ДНК, которые белок узнает. При этом разные сайты связывания могут соответствовать одному мотиву, а с другой стороны, один сайт может подходить сразу нескольким мотивам, которые узнаются разными ТФ. Для «обычных» ТФ большая часть функциональных сайтов связывания концентрируется в промоторах и энхансерах генов и таким образом влияет на экспрессию генов. Таким образом, по словам авторов статьи, полученные в Codebook данные — это важный шаг в понимании механизмов реализации информации, содержащейся в геноме человека.

 

Геномная «темная материя»

Статья в Nature Communications посвящена тому, как в ходе проекта Codebook удалось через призму факторов транскрипции разобраться в части геномной «темной материи» — так неформально называют плохо охарактеризованную часть генома, состоящую в основном из повторяющихся последовательностей и мобильных элементов, функции которой остаются во многом неизвестными.

«Геномная „темная материя“ — это, вероятно, результат экспансии каких-то древних мобильных элементов, — объясняет Всеволод Макеев, — некоторые из которых в ходе эволюции были рекрутированы в регуляторные элементы».

«В геноме человека накоплена масса повторов, — добавляет Иван Кулаковский, — и иногда клетка эти участки приспосабливает для своих целей: например, фрагмент повтора может стать промотором какого-нибудь белок-кодирующего гена. А есть и такие замечательные истории, когда белок или часть белка мобильного элемента становится фактором транскрипции, а участки его связывания могут становиться функциональными сайтами связывания в геноме человека. Это немного экзотический, но живой способ эволюции. При этом есть исчезающе мало примеров, когда был напрямую "одомашнен и приспособлен" и ДНК-связывающий домен и его участки связывания. Удивительно, что еще один такой белок нашелся у человека среди малоизученных ТФ Codebook».

Изученные в Codebook транскрипционные факторы исследователи разделили по тому, в каких районах они связывают ДНК. Из 166 ТФ, для которых удалось определить участки связывания в живых клетках, примерно половина связывается с известными регуляторными областями — промоторами и энхансерами. Вторая половина предпочитает «темную материю», причем у каждого белка свой, почти не пересекающийся с другими набор участков; 54 таких белка авторы выделили в отдельную группу «темных» ТФ. Это чаще всего области закрытого хроматина, удаленные от генов. Многие «темные» ТФ — это цинковые пальцы с KRAB-доменом: ион цинка стабилизирует его укладку, а с ДНК контактируют аминокислотные остатки его альфа-спирали. У многих «темных» ТФ есть репрессорная функция — KRAB-содержащие белки известны как глушители мобильных элементов, — но так устроены далеко не все. Среди «темных» нашлись и «пионерные» факторы: они способны садиться на закрытый, конденсированный хроматин и менять его состояние, после чего на эти участки могут приходить обычные ТФ и запускать регуляторную программу.

Как белок находит участок ДНК?

Еще одна статья в Nature Communications посвящена методу SMiLE-seq, разработанному в лаборатории Барта Депланка в EPFL, и его новой модификации meSMiLE-seq, чувствительной к метилированию ДНК. Обычным SMiLE-seq исследователи проанализировали 284 предполагаемых ТФ и получили 74 новых мотива. Метилчувствительным вариантом SMiLE-Seq прогнали 114 белков и для 48 построили мотивы, учитывающие сродство к метилированной и неметилированной ДНК. Среди них нашлись факторы, предпочитающие метилированные мотивы, предпочитающие неметилированные и индифферентные к метилированию. Отдельная находка — несколько ТФ, которые связываются только с метилированной ДНК: именно поэтому они оставались без мотивов по данным всех остальных методов, использованных в Codebook. 

Четвертая статья, опубликованная в Nature Methods, посвящена методу GHT-SELEX — геномному варианту высокопроизводительного SELEX, в котором вместо пула случайных олигонуклеотидов используется фрагментированная геномная ДНК, — и полученным с его помощью результатам. Объясняя значение метода, Иван Кулаковский обозначил проблему: молекулярные биологи и биоинформатики по-разному представляют себе, как регуляторный белок находит нужный участок ДНК. Подводит ли туда белок электростатика, укладка хроматина и другие белки? Находит ли белок сайт самостоятельно, путем сканирования ДНК или прыжков? Способна ли биоинформатическая модель, описывающая только короткий мотив, адекватно отражать связывание белка в геноме? Сколько в геноме сайтов связывания, и для каких из них контакт с белком приводит к функциональным последствиям для клетки? Поиск ответов на эти вопросы сегодня привел к пониманию, что существует континуум участков связывания: где-то белок садится чаще, где-то реже, одни связи сильнее, другие слабее. В контексте проекта Codebook, именно GHT-SELEX помог ответить на вопрос, способен ли белок в масштабах огромного генома самостоятельно найти свои участки связывания, и можно ли их предсказать достоверно по последовательности ДНК, используя очень простой классический биоинформатический метод. По результатам Codebook положительный ответ на оба вопроса удалось дать для десятков белков, которые умеют это делать «в пробирке», без дополнительных факторов, имеющихся в клетке.

О работе над «Шифровальной книгой», и зачем она нужна

В ноябре 2025 года вышла первая статья в журнале Сommunications Biology, в которой биоинформатики проекта Codebook под руководством российской команды сравнили разные биоинформатические методы для поиска мотивов связывания ТФ по различным типам экспериментальных данных. Эта техническая статья была методической предпосылкой для опубликованных сейчас основных результатов проекта.

«Проект был очень долгим и очень затратным по времени и по взаимодействию, и надо отдать должное Тиму Хьюзу, что он этот корабль довел до какой-то гавани, — рассказывает Всеволод Макеев. — Экспериментаторы ставили бесконечные эксперименты, их было гораздо больше, чем 4000, потому что некоторые по два-три раза переделывали. Аналогично было с вычислениями. Надо отдать должное коллегам из Университета Мартина Лютера в Галле, которые предоставили нам свой кластер». 

«И новосибирской команде под руководством Федора Колпакова, — добавляет Иван Кулаковский. — Они перенесли всю инфраструктуру, которую создавали в России, на большой компьютер в Германии, было такое общее рабочее пространство, которое они создали и поддерживали; без их участия проект бы не взлетел».

«Вообще это консорциум на энтузиазме, он был собран снизу, за счет того, что несколько групп решили: это интересная задача, которую имеет смысл решать, — подчеркивает Макеев. — Такой большой проект, в котором мы много чего делали как организаторы, — для нас первый опыт, я бы сказал, прыжок выше головы. Ну и по результатам: раньше мы не знали всех мотивов сайтов связывания транскрипционных факторов человека, а теперь знаем. Это как материк — был голландец, который впервые оплыл Австралию, и стало ясно, где Австралия, а где нет. Это такая вещь, которую только один раз можно сделать».

«Да, а если отвечать на вопрос, зачем вообще это нужно знать, — добавляет Иван Кулаковский, — то один ответ: чтобы аннотировать мутации в регуляторных районах. Мы сейчас со школьниками этим занимаемся. А второй ответ: чтобы определять, по какому пути клетки выходят в дифференцировку, чем отличаются генные сети в "здоровых" и "больных" клетках различных типов. Мы попробовали предсказать экспрессию генов в очень разных клетках, используя в том числе новые мотивы, полученные в ходе проекта. И выяснилось, что транскрипционные факторы Codebook связаны с дифференцировкой нервных клеток и с развитием различных онкологических заболеваний. Кроме того, расширенная коллекция мотивов ТФ человека оказалась полезна для анализа генной регуляции не только у человека, но и у других видов со сходным набором транскрипционных факторов. В частности, в Институте биохимии и генетики УФИЦ РАН в Уфе результаты Codebook уже используют при реконструкции регуляторных генных сетей, определяющих хозяйственно важные признаки разных пород свиней.»

 

 

---